引物加了保护碱基和酶切位点（共14个碱基）后退火温度需要调整吗?

来源：学生作业帮助网编辑：作业帮时间：2024/05/05 21:58:50

引物加了保护碱基和酶切位点（共14个碱基）后退火温度需要调整吗?
引物加了保护碱基和酶切位点（共14个碱基）后退火温度需要调整吗?

引物加了保护碱基和酶切位点（共14个碱基）后退火温度需要调整吗?
引物的3’端要与模板严格配对,而5’端碱基没有严格的限制,只要与模板DNA 结合的部分足够长,其5’端碱基可不与模板DNA配对而呈游离状态,这样,我们可以在引物的 5 末端加上酶切位点,因此退火温度依然取决于之前引物的退火温度.

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其实加酶切位点的引物，和overlap PCR的引物原理是一样的，根本不用计算第一轮不匹配的多余碱基，至于后面的循环，原理就像是Touchdown PCR。因为温度与PCR的特异性是正比，但和PCR的效率是反比的，因此Touchdown PCR的前面的循环退火温度较高，保证了扩增的特异性，在特异的PCR产物丰度渐渐上升，就把退火温度慢慢降下来，提高扩增的效率，这种方法在模板复杂度较高（cDNA，全基因组等）的PCR中扩增低拷贝模板效果是非常不错的。当然做克隆的模板不会复杂，不计算附加碱基也不是为了做Touchdown，只是说不用担心后面扩增退火温度低造成的影响。
我是认为不用计算附加碱基，如果要调整PCR的特异性，只是提高退火温度就好了，这个提高不是以附加碱基为基础的。克隆实验倒是无所谓，如果你是要在附加碱基中加入一个小Tag等比较长的片段，计算了附加碱基，就有可能扩增不出来。
如果非要强调特异性的话，我觉得也应该最初几个循环的退火温度为不计算附加碱基的Tm，而之后就要升高为计算附加碱基的Tm。这种PCR也是有的，比如ACP－PCR（GENE Fishing）和TAIL－PCR及其几种改进方法。

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引物加了保护碱基和酶切位点（共14个碱基）后退火温度需要调整吗? 引物18个碱基互补序列,Tm值60左右,加上酶切位点和保护碱基后,Tm值就72了,这么高Tm行吗?能帮我看下,这样设计的引物对吗ATGC TCTAGA GC TCAGATGTCCACGTCCCG前面四个和第11、12个（GC）是保护碱基,中间6 PCR时引物的概念包括加进去的酶切位点和保护碱基嘛?算进引物的长度吗?一块分析嘛?我设计的下游引物只有15个碱基,但primer5上的长度18个,如果我删去三个就不配对了（只是下游引物）,影响任何PCR引物都需要加保护碱基嘛? 设计的引物19个碱基,其中包括6 bp的酶切位点和3个保护碱基,和模板配对的只有11个碱基,是不是太短?该引物用于基因.19个碱基的引物是不是肯定不能扩增出目的基因? 设计引物的时候,酶切位点的前面的保护碱基应该怎么加,遵循什么原则. 请教各位我设计引物加了酶切位点和六个保护碱基,结果扩出来的片段短了,缺少我之前设计引物那段互补片段请教各位我设计引物能扩增出目的片段,测序结果正确,设计表达引物直接在上面加做克隆时,请问在引物前加的一段保护碱基和内切酶序列需要和cDNA互补吗? 酶切位点保护碱基引物设计怎么加保护性碱基各位看看我的引物酶切位点和保护碱基有什么问题吗5’-CCTGAATTCATGGCTAGCCTTCTCA-3’5’-CCGCTCGAGTATTTA ATTGAATAGTT-3’ PCR 引物怎么加保护碱基,一定要按特意序列吗? 我想问问我加的酶切位点和保护碱基对不对AIF-ECOR1：cg gaattc gctacaagcacgctctaacatct AIF-BAMH1: c ggatcc cggactctgtctcactctctgat 保护碱基和酶切位点我用空格分开了,好辨认!扩出来后准备双酶切后连接质再设计引物时,添加酶切位点和标签后,正反两个引物相差20个碱基,但在添加前相差不大, rsrii酶切位点的保护碱基是什么啊?有哪位高人知道rsrii这个酶切位点的保护碱基是什么啊?我最近要设计引物用到这个酶切位点的,可查不到它的保护碱基, 我从PMD18-T上克隆目的基因,用的是Ecor I 和Not I酶切位点,引物Not I只有一个保护碱基,这样可以吗? 有关PCR引物设计好像引物设计好以后,还要添加什么保护碱基,有时还要添加酶切位点,这些东西添加进去后,不是无法和模板链连接起来了吗?除非是把引物设计的所有要求统一起来,在模板链上克隆设计引物插入酶切位点的问题我要对真菌的全序列进行克隆,设计引物时是不是讲酶切位点插入到5’端就可以了?加的保护基团在酶切位点之前加就可以吗,它是随便的三个碱基吗?限制性