作业帮（求助）如何提高ELISA灵敏度
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/17 06:54:00
（求助）如何提高ELISA灵敏度
（求助）如何提高ELISA灵敏度
（求助）如何提高ELISA灵敏度
那时阴性对照的OD值有时甚至高于样品,请各位指点一下.你的两种抗体针对的抗原决定簇是否相同?如果相同,降低包被抗体的浓度试一下.道理如此：如果包被抗体浓度过高,而抗原浓度低时,抗体则与抗原的大多数或全部抗原决定簇结合,导致标记抗体不能与抗原结合.我用的包被抗体是单抗,一抗则是多抗,包被抗体是将买来的抗体1：10000稀释后使用的,应该不会浓度过高吧.其他还会有什么因素吗?maqingwen wrote:我用的包被抗体是单抗,一抗则是多抗,包被抗体是将买来的抗体1：10000稀释后使用的,应该不会浓度过高吧.其他还会有什么因素吗?为什么包被抗体是单抗而一抗是多抗,这样放大倍数会不够吧.
我认为,你的一抗应该针对研究的抗原决定簇,而二抗应该是抗一抗的多个决定簇,这样就会将底物放大很多倍,而且还会比你现在的特异性强,就避免了阴性对照过强.
要是不能换抗体的话,试试调整实验条件：包被时间,调整浓度,增加洗脱次数,增加抚育时间,
这种说法太主观.有些抗体的浓度很高,在ELISA时要做系列浓度摸索.因为在你的实验中,抗原浓度是未知的,因此,可如下：取一固定抗原浓度（要低一点,如100ug/ml）,而把抗体浓度做不同浓度稀释,如：1：10000,1：20000,1：30000等.然后ELISA,找出能检测到抗原明显反应的抗体浓度,即为最适包被抗体浓度.Fang CY wrote:你的两种抗体针对的抗原决定簇是否相同?如果相同,降低包被抗体的浓度试一下.道理如此：如果包被抗体浓度过高,而抗原浓度低时,抗体则与抗原的大多数或全部抗原决定簇结合,导致标记抗体不能与抗原结合.你的意思是一抗与二抗全是抗底物的?
我认为,你的一抗应该针对研究的抗原决定簇,而二抗应该是抗一抗的多个决定簇,这样就会将底物放大很多倍,而且还会比你现在的特异性强,就避免了阴性对照过强.
要是不能换抗体的话,试试调整实验条件：包被时间,调整浓度,增加洗脱次数,增加抚育时间,
不知对否!Fredreic 兄,Fang cy是说对了的,maqingwen用的是“双抗体夹心法”!再去看看吧各位觉得包被抗体和一抗的浓度比例多少合适?二抗是不是低一点有利于减少阴性的非特异性显色?maqingwen wrote:各位觉得包被抗体和一抗的浓度比例多少合适?二抗是不是低一点有利于减少阴性的非特异性显色?减少染色时间,增加洗脱液的体积及洗脱次数、强度.能说得具体一点吗?比如洗脱液用哪一种,反应时间缩短多少可能好一点?我觉得是否可以用内参比法,就是在样本中加入一些标准品,这样,使所检测的范围在你的试剂灵敏度范围内,等于是提高了灵敏度这种方法可信度如何?如果样品中待测抗原的浓度很低的话,你用内参法得出的结果很可能是测定的误差造成的.各位说得有道理,我在这里想说的是,很多公司提供的单抗,其实里面有其他蛋白质,因为纯化的抗体保存时如果没有其他蛋白质,极易沉淀,并导致效价下降.你买的单抗可能含有其它蛋白质,因此,包被时,你的单抗可能只有一部分吸咐在酶标板上,这样当然敏感性不够高.此外,我以前做ELISA时.一般是包被抗体用多抗,检测抗体用单抗,这样包被抗体可以捕获较多的抗原,而单抗作为检测抗体,可以保证其较低的本底.仅供参考!